Samstag, den 2. Dezember 2000
 
 

Tagungsort:

 Chausseestraße 117, 2. Hinterhof, Dachgeschoß, Raum 551

 Institut für Biologie, Humboldt-Universität Berlin, 10115 Berlin
 
 

Programm
 
 

9:00 - Begrüßung (Prof. T. Buckhout)
 
 

Session 1 (Leiter: Immo Reinhardt)
 
 

9:05 - Ulrike Simon-Rosin und Michael Udvardi. Molecular and cellular characterisation of two functional ammonium transporters from root nodules of the model legume Lotus japonicus

9:20 - Christian Sohlenkamp und Michael Udvardi. Ammonium Transport in Arabidopsis thaliana

9:35 - Ali Alawday, Jutta Papenbrock und Bernhard Grimm. Expression and function of Mg-Protoporphyrin IX methyltransferase

9:50 - Inna Lermontova und Bernhard Grimm. Molecular biological and physiological characterisation of two isoforms of tobacco protoporphyrinogen IX oxidase

10:05 - Valeria Voronetskaya, Inna Lermontova, Xavier Reboud, Tatiana Ezhova und Bernhard Grimm. Novel strategies to confer resistance against peroxidising herbicides
 
 

10:20 - Pause
 
 

Session 2 (Leiter: Oliver Thimm)
 
 

10:45 - Amélie Kelly, John Froehlich, Christoph Benning und Peter Dörmann. Galactolipid-Biosynthese in Arabidopsis thaliana

11:00 - Melanie von Orlow, Elmar Hartmann und Peter Dörmann. Synthesis and Function of Membrane Lipids in Physcomitrella patens

11:15 - Karsten Krepinsky und Claus Schnarrenberger. Cyanobakterieller Ursprung der Isoenzyme der 6-Phosphogluconat Dehydrogenase aus Spinat

11:30 - Nadja Diane und Hartmut H. Hilger. Molekulare Systematik einiger Vertreter der Heliotropiaceae SCHRAD. (Boraginales)

11:45 - Adi Rahmat and Kurt Zoglauer. Somatische Embryogenese bei Nordmannstanne (Abies nordmanniana L.)
 
 

12:00 - Mittagspause (Treffen der Planungskomitee)
 
 

Session 3 (Leiter: N.N.)
 
 

13:00 - Angelika Mustroph, G. Albrecht und E.-M. Wiedenroth. Die Rolle von Glycolyse und Fermentation unter Sauerstoffmangel bei unterschiedlich staunässetolerante Getreidearten

13:15 - Hany Sror , Dirk Hincha und Jürgen Schmitt. Cryoprotectin binds to thylakoid membranes and reduces membrane fluidity

13:30 - H. Winter, A. Diestel, S. Gärtig, N. Krone und M.D. Sacristán. Untersuchungen zum Transfer von Resistenzen gegen Leptosphaeria maculans in den Raps

13:45 - Oliver Thimm, Bernd Essigmann, Thomas Altmann und Thomas Buckhout. Expressionsanalyse der Eisenmangelantwort an Arabidopsis thaliana

14:00 - Immo Reinhardt, Luca Canuti, Alexandra Herbik und Thomas J. Buckhout. Unterschiede im Proteinmuster von Chlamydomonas reinhardtii in Abhängigkeit von der Eisenernährung

14:15 - Pause
 
 

Session 4 (Leiter: N.N.)
 
 

14:45 - Carola Emanuel, Thomas Börner und Andreas Weihe. Untersuchungen zur Expression organellärer RNA-Polymerasen in Arabidopsis thaliana

15:00 - Slobodan Ruzicic und Kerstin Schulz. DOF-Transkriptionsfaktoren: Funktionsanalyse in Schließzellen und anderen Geweben

15:15 - Stephan Brandt, Kathleen Arlt, Lothar Willmitzer und Julia Kehr Einzelzellanalytik hinsichtlich der Ionen- und Aminosäurekonzertionen und der Genexpression in Blättern

15:30 - Arne Schäfer und Thomas Altmann. Positionsklonierung des SCB1 Gens aus Arabidopsis thaliana

15:45 - Schlußwort und Ankündigung des XII.Havel-Spree-Kolloquiums (Prof. T. Buckhout)
 

Molecular and cellular characterisation of two functional ammonium transporters from root nodules of the model legume Lotus japonicus

Ulrike Simon-Rosin and Michael Udvardi

 Max Plank Institute of Molecular Plant Physiology, Am Mühlenberg 1, 14476 Golm, Germany

 Most of the ammonium produced during symbiotic nitrogen fixation in legume root nodules is assimilated by the plant. Ammonium assimilation, which is instigated by glutamine synthetase, occurs in the cytoplasm and, to a lesser extent, in plastids of infected and uninfected cells. Ammonium transporters participate in moving ammonium from bacteroids to various sites of assimilation. However, little is known about the molecular biology of these transporters. We have isolated the first bona fide ammonium transporters from a legume, Lotus japonicus. Two ammonium transporters, LjAMT1;1 and LjAMT2;1 were isolated from a Lotus nodule cDNA library and they represent two distinct families of proteins. The two transporters share 26 % sequence identity, and are homologous to ammonium transporters from bacteria, animals, and other plant species. Functionality of both transporters was confirmed by expression in yeast. The genes encoding the two transporters exhibited different patterns of expression throughout the plant and within nodules. Transcripts of LjAMT1;1 were more abundant in leaves and stems than in roots or nodules. The LjAMT2;1 gene appeared to be constitutively expressed in all organs tested. In situ RNA analysis revealed transcripts of LjAMT1;1 in cells of the infected tissue as well as of vascular bundles. Lower expression was observed in cortical cells. In contrast, LjAMT2;1 transcripts appeared to be abundant in cells of the cortex and vascular tissue. Relatively weak expression of LjAMT2;1 was detected in cells of the infected zone. The possible physiological roles of the two ammonium transporters in nodules are considered in detail.

Ammonium Transport in Arabidopsis thaliana

Christian Sohlenkamp and Michael Udvardi

 Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Am Muehlenberg 1, 14476 Golm

 Ammonium (NH4+) is an important source of nitrogen for many plants. It is taken up from the soil by one or more specific transporters in the plasma membrane of root cells. In addition to the uptake of NH4+ from the soil, ammonium transporters are possibly involved in the transport of NH4+ to different subcellular targets like vacuole or plastids. In A. thaliana three different members of the AMT1 family of NH4+ transporters have been characterized and the Arabidopsis genome project has revealed the sequences of two more closely related genes. The expression patterns of the characterized AMT1 family members suggest that some of these are involved in the uptake of NH4+ from the soil. Recently, we have used functional complementation of a yeast mutant deficient in ammonium uptake to characterize AMT2, the first member of a novel family of ammonium transporters in plants. It shows only 23-25% identity on amino acid level to NH4+ transporters of the AMT1 family and is more closely related to some bacterial NH4+ transporters. AMT2 is expressed throughout the whole plant and is the first plant NH4+ transporter that is more highly expressed in green tissue than in roots. Homologues of AMT2 recently also have been identified in different other plants like L. japonicus, M. truncatula and wheat. We are currently using the tools of cell biology, reverse genetics and physiology to determine the sub-cellular location and physiological roles of AMT2 in A. thaliana.

 Keywords: ammonium, transport, Arabidopsis

 Phone: ++49-331/567-8149

 Fax: ++49-331/567-8250

 Udvardi@mpimp-golm.mpg.de
 

Expression and function of Mg-Protoporphyrin IX methyltransferase

Ali Alawday, Jutta Papenbrock1 and Bernhard Grimm

 Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK), Gatersleben, Germany

 1Institute of Botany, University of Hannover, Hannover, Germany

Mg-Protoporphyrin IX methyltransferase (CHL M) is an enzyme of the chlorophyll-forming branch of tetrapyrrole biosynthesis. It is proposed that the enzyme is in close interaction to the preceding enzyme, Mg chelatase, a highly regulated enzyme of the pathway. CHL M catalyses the specific transfer of a methyl group to the carboxyl group of the 6-propionat of Mg-protoporphyrin IX. The Chl M cDNA sequence was identified from a tobacco cDNA library. The CHL M protein has a molecular mass of 33.2 kDa and contains an amino terminal transit sequence for the translocation into chloroplasts. The recombinant tobacco precursor and mature CHL M that were over-expressed in E. coli synthesise Mg-protoporphyrin IX monomethylester using S-adenosyl-L-methionine (SAM) as a cofactor, while a peptide that lacks 90 amino acids at the amino terminal end is entirely inactive. Expression studies in tobacco wild-type plants show a transient maximum level of Chl M RNA, the protein and its enzyme activity during plant development. The steady-state level of the Chl M transcript slightly accumulates during greening of etiolated tobacco seedlings. While Chl M RNA and protein content did not vary under a 12 h light/12 h dark regime, the CHL M activity showed a transient increase in the middle of the light period. Mg Chelatase activity was highly induced immediately after the transition from dark to light. This activity peak caused a rapid increase of the Mg protoporphyrin level in the first two hours of illumination. We assume that Mg chelatase or its catalytic product, Mg protoporphyrin, triggers the stimulation of the CHL M activity.

 A binary vector containing the full-length Chl M cDNA in sense and antisense orientation behind the 35S CaMV promoter was transformed to tobacco SNN wild-type plants. Transgenic tobacco plants with decreased or increased CHL M expression and activity were used to investigate the significance of this protein for the metabolic regulation of chlorophyll synthesis and the close interaction to Mg-Chelatase. Transformants over-expressing CHL M show higher CHL M activity, a lower level of Mg protoporphyrin and higher amounts of the monomethylester than the control plants. Other transformants containing Chl M-sense genes form pale green leaves. The plants are characterized by suppressed CHL M expression, lower CHL M activity and accumulation of Mg protoporphyrin in comparison to control plants. The antisense plants display a similar pale green phenotype which corresponds also to lower CHL M protein content and its activity leading to accumulation of Mg protoporphyrin.

Molecular biological and physiological characterisation of two isoforms of tobacco protoporphyrinogen IX oxidase

Inna Lermontova and Bernhard Grimm

 Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK), Gatersleben, Germany

 Protoporphyrinogen IX oxidase (PPOX) is the last enzyme in the common pathway of heme and chlorophyll biosynthesis. We cloned two different full-length tobacco cDNA sequences encoding plastidal and mitochondrial protoporphyrinogen IX oxidase, respectively, which were designated PPOX I and PPOX II. Protoporphyrinogen oxidase is also the molecular target of diphenyl ether type (DPEs) herbicides. Their inhibitory mode of action is explained by rapid oxidation of accumulating protoporphyrinogen IX to the photosensitising protoporphyrin IX, which subsequently generates reactive oxygen species during oxidative breakdown.

Transgenic plants with overexpression or deficiency of both PPOX, respectively, were generated to explore the consequences of perturbed expression of each isoform on tetrapyrrole biosynthesis, on the antioxidative protection mechanism and on herbicide resistance. Transgenic plants expressing PPOX I antisense genes showed reduced levels of PPOX I leading to severely damaged plants with dwarf-phenotype. Surprisingly, the formation of necrotic leaf lesions inversely depended on the light intensity. The levels of antioxidants in transgenic and control plants grown under low and high light conditions were investigated and a mechanism of photosensitization will be proposed.

Transgenic tobacco plants overexpressing either the plastidal or mitochondrial isoform of PPOX were generated to test their tolerance against peroxidizing herbicides. Plants with overexpressed Arabidopsis PPOX I showed resistance against acifluorfen, while plants overexpressing PPOX II showed only reduced accumulation of protoporphyrin IX upon herbicide treatment. Different experiments were performed to elucidate the resistance mechanism.

 In addition, the tobacco PPOX I cDNA sequence was randomly mutagenised in the E. coli XL-Red mutator strain. The mutated plasmids were retransformed into the E. coli hemG mutant and resistant bacterial colonies were selected on increasing concentrations of the PPOX inhibitor acifluorfen. Three PPOX I-cDNAs identified from resistant bacterial clones showed always a single point mutation in the coding region leading to substitution of different amino acid residues, respectively. All three mutant amino acid residues belong to highly conserved regions in the PPOX I sequence.

Novel strategies to confer resistance against peroxidising herbicides

Valeria Voronetskaya, Inna Lermontova, Xavier Reboud1, Tatiana Ezhova2 and Bernhard Grimm

 Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK), Gatersleben, Germany

 1Laboratoire de Malherbologie et Agronomie, 21034 Dijon, France

 2Institute of Genetics, Moscow-State-University, Moscow, Russia

 The plant biosynthetic pathway of tetrapyrroles leads to the formation of two main endproducts, chlorophyll and heme. Chlorophyll is a light harvesting pigment, heme is a cofactor of many different proteins, such as haemoglobin, cytochrome, peroxidase and catalase. Protoporphyrinogen IX oxidase (PPOX) is the last enzyme in the common pathway of tetrapyrrole biosynthesis and provides precursors for the mitochondrial and plastidal heme synthesis and the predominant chlorophyll synthesis in plastids. PPOX is of particular interest for two reasons: The deficiency in the activity of this enzyme has been associated with the human inherited disease variegate porphyria. Secondly, PPOX is the cellular target for a number of peroxidising herbicides, such as acifluorfen. Many of these inhibitors competitively inhibit the catalytic reaction of PPOX and act as substrate analogues. The predicted mode of action of PPOX-inhibiting herbicides includes accumulation of protoporphyrinogen IX in the chloroplast and its subsequent leakage into the cytosol where it is oxidised to protoporphyrin. Protoporphyrin is further photooxidised and causes the generation of singlet oxygen resulting lipid peroxidation and membrane disruption.

 The major objective of my work is the analysis of novel strategies of plants to obtain resistance against peroxidising herbicides. To achieve this goal, Arabidopsis thaliana and Chlamydomonas reinhardtii mutants were selected for tolerance against the herbicide acifluorfen. Secondly, transgenic Arabidopsis plants expressing mutant PPX I from Nicotiana tabacum were generated. The herbicide resistance of plants and algae could be due to either structural changes of PPOX leading to reduced accessibility or affinity of the enzyme to the inhibitor, to over-expression of PPOX or to improved protection against reactive oxygen species. All plants and algae with increased tolerance against the PPOX inhibitor were analysed with biochemical and genetical methods, including Northern and Western analysis of PPOX, foliar spraying and leaf disc incubation of the herbicide, analysis of porphyrins and tetrapyrrolic endproducts. Sequencing of the tobacco mutant PPOX I revealed four single point mutation resulting in substitution of different amino acid residues. The antioxidative protection system was investigated in mutants at different levels of expression.

 Four mutant Chlamydomonas cultures were selected on acifluorfen-containing medium. The mutants displayed a up to 200-fold increased tolerance against acifluorfen in comparison to the wildtype strains. Apart from the new property of PPX-inhibitor resistance other metabolic changes in tetrapyrrole biosynthesis were not determined in these mutants. Investigations on the expression levels of PPOX, the contents of tetrapyrrole intermediates and endproducts, activities of antioxidants will be presented.

Galactolipid-Biosynthese in Arabidopsis thaliana

Amélie Kelly1, John Froehlich2, Christoph Benning2 und Peter Dörmann1

 1Max-Planck-Insitut für Molekulare Pflanzenphysiologie, 14476 Golm, Germany

 2Plant Research Laboratory and Department of Biochemistry, Michigan State University, East Lansing, MI 48824, USA

 Die Galactolipide Monogalactosyl- und Digalactosyldiacylglycerol machen den Hauptanteil der Lipide in den Thylakoiden und in den Hüllmembranen der Chloroplasten höherer Pflanzen aus. MGDG wird aus UDP-Galactose und Diacylglycerol durch die MGDG Synthase synthetisiert. Die DGDG Synthase setzt darauf hin MGDG zu DGDG um. Durch Komplementation der Arabidopsis dgd1 Mutante, in der das DGDG Lipid auf 10 % des Wildtyp-Gehalts reduziert ist, konnte kürzlich das DGDG Synthase Gen DGD1 isoliert werden. Ein zweites Gen in Arabidopsis, "DGD2" zeigt eine hohe Sequenzhomologie zu DGD1. Rekombinante Expression der beiden cDNAs in E. coli führt zur Synthese von DGDG Lipid, jedoch nur bei Co-expression mit der MGDA Synthase. Daraus folgt, dass MGDG als Substrat notwendig zur DGDG Synthese durch DGD1 und DGD2 ist. Ebenso konnte gezeigt werden, dass der C-terminale Teil des DGD1 Proteins, welcher Homologie zu anderen Galactosyltransferasen zeigt, zur Syntheses des DGDG Lipids ausreicht. Die Funktion des N-terminalen Teils von DGD1 ist unbekannt. Daher suchen wir zur Zeit gezielt nach einer markierten dgd1 knock-out Mutante in Arabidopsis mit einer Insertion in diesem Teil des Proteins. Eine solche Mutante sowie eine weitere Mutante mit einer Insertion im offenen Leseraster von DGD2, die wir vor kurzem identifiziert haben, werden zur Aufklärung der Biosynthese und Funktion der Galactolipide in höheren Pflanzen beitragen.

Synthesis and Function of Membrane Lipids in

Physcomitrella patens

Melanie von Orlow1, Elmar Hartmann1 and Peter Dörmann2

 1Freie Universität Berlin, Institut für Pflanzenphysiologie, 14195 Berlin, Germany

 2Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie, 14476 Golm, Germany

 The pathways of lipid biosynthesis are known to form a complex network which leads to numerous lipids of different classes such as neutral lipids, glycolipids and phospholipids. In contrast to higher plants, gene expression in the moss Physcomitrella patens can be altered by targeted gene disruption via homologous recombination. In yeast and bacteria, decarboxylation of phosphatidylserine (PS) is the dominant pathway for phosphatidylethanolamine (PE) synthesis, one of the abundant phospholipids in these organisms. In plants, PE can be directly synthesized from CDP-ethanolamine and diacylglycerol. It is not known if PS decarboxylation contributes to PE biosynthesis in plants as well. Because PS does not accumulate to high amounts in plants, it has been questioned if this lipid plays any role in membrane assembly. By screening a cDNA-library with an expressed sequence tag (EST) from Arabidopsis showing sequence similarity to the PS decarboxylase (PSD) genes of yeast and Escherichia coli, we isolated a partial cDNA that presumably encodes the PS decarboxylase from Physcomitrella patens. The missing 5' end of this cDNA was isolated by 5' RACE. The protein sequence of the full-length cDNA shows stronger similarity to the PSD2 protein of yeast than to the yeast PSD1 or the E. coli PSD proteins. Furthermore, the Physcomitrella protein sequence contains the conserved motive GGSTV located close to the C-terminus. Processing of the pre-protein by cleavage within this site leads to the formation of the enzymatically active á and â subunits in yeast and bacteria. We are currently using the Physcomitrella PSD cDNA for functional characterization by expression in E. coli wild-type and psd mutant as well as generation of a null mutant in Physcomitrella by targeted gene disruption.

Cyanobakterieller Ursprung der Isoenzyme der 6-Phosphogluconat Dehydrogenase aus Spinat

Karsten Krepinsky und Claus Schnarrenberger

 Institut für Pflanzenphysiologie und Mikrobiologie, Freie Universität Berlin, Königin-Luise-Str. 12-16a, 14195 Berlin

 Pflanzen besitzen plastidäre und cytosolische Isoenzyme für das zweite Enzym des oxidativen Pentosephosphat-Weges, die 6-Phosphogluconat Dehydrogenase (6-PGDH). Die chloroplastidäre 6-PGDH aus Spinatblättern wurde 1000fach bis zur Homogenität gereinigt. Eine spezifische Aktivität von 60 U/mg wurde bestimmt. Das Enzym ist ein Homodimer mit Untereinheiten von 50 kDa. Das gereinigte Protein wurde gespalten, einzelne Peptide sequenziert. Die cDNA der chloroplastidären 6-PGDH wurde mittels PCR in Anwesenheit von degenerierten Primern gegen die sequenzierten Peptide bestimmt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz schließt ein serinreiches Transitpeptid ein. Die cDNA der cytosolischen 6-PGDH wurde ebenfalls bestimmt und zeigt eine Identität von 74 % zu dem chloroplastiären Isoenzym. Der Stammbaum der 6-Phosphogluconat Dehydrogenasen zeigt, daß sowohl das chloroplastidäre als auch das cytosolische Isoenzym cyanobakteriellen Ursprungs sind. Sie gingen aus einer Genduplikation in der frühen pflanzlichen Evolution auseinander hervor.

Molekulare Systematik einiger Vertreter der Heliotropiaceae SCHRAD. (Boraginales)

Nadja Diane und Hartmut H. Hilger

 Institut für Systematische Botanik und Pflanzengeographie, FU Berlin, Altensteinstr. 6, D-14195 Berlin, Germany

Es wurde versucht, die systematischen Beziehungen zwischen einigen Vertretern der Heliotropiaceae SCHRAD., mit Hilfe der Sequenzanalyse der ITS1-Region der nrDNA zu klären. Einbezogen in die Untersuchung wurden Arten von Heliotropium, Tournefortia, Myriopus, Schleidenia, Ixorhea und Ceballosia. Die Ergebnisse bestätigen die Monophylie der Heliotropiaceae. Die Analyse der molekularen Daten zeigt vier klare Entwicklungslinien auf. Über morphologische Merkmale sowie die Verbreitung einiger Taxa können die molekularbiologischen Ergebnisse gestützt werden. Tournefortia Sektion Cyphocyema einschließlich Myriopus bilden die Schwestergruppe zu allen anderen in die Untersuchung einbezogenen Taxa. Heliotropium Sektion Orthostachys inklusive Schleidenia bilden gut gestützt die Schwestergruppe zu allen anderen Taxa von Heliotropium (außer Sektion Orthostachys), Tournefortia Sektion Eutournefortia und Ceballosia. Hinsichtlich Heliotropium bestehen zwei weitere Entwicklungslinien. Eine Enwicklungslinie umfaßt die neuweltlichen Heliotropium-Arten einschließlich Tournefortia Sektion Eutournefortia und Ceballosia. Die zweite Entwicklungslinie repräsentiert die Heliotropium-Arten der Alten Welt. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit einer taxonomischen Umkombination der untersuchten Taxa auf.

 http://www.biologie.fu-berlin.de/sysbot/

 email: hahilger@zedat.fu-berlin.de

 Tel. ++49 30 838 6512

 Fax ++49 30 838 5434

Somatische Embryogenese bei Nordmannstanne

(Abies nordmanniana L.)

Adi Rahmat and Kurt Zoglauer

 AG Angewandte Botanik, Institut für Biologie der Humboldt-Universität zu Berlin, Invalidenstr. 42, 10115 Berlin

 Die Nordmannstanne, deren natürliche Verbereitungsgebiete die höheren Lagen des Kaukasus und der nordöstlichen sind, wird in großem Umfang für die Erzeugung von Weihnachtsbäumen kultiviert. Die Bereitstellung von hochwertigen Saatgut ist problematisch, und auch eine vegetative Vermehrung über Stecklinge oder durch Organogenese in vitro ist nicht möglich. Die somatische Embryogenese ist bei Tannenarten ein aussichtsreicher Ansatz zur Entwicklung von Verfahren für die vegetative Massenvermehrung. Trotz respektable Fortschritte in den letzten Jahren sind grundlegende Forschungsarbeiten insbesondere zur Steuerung der Embryonalentwicklung und zur Jungpflanzenanzucht erforderlich. In Abhängigkeit vom Entwicklungsverlauf der somatischen Embryonen gliedern sich die Untersuchungen in fünf Abschnitte: Induktion somatischer Embryogenese, Vermehrung embryogener Kulturen (bezeichnet als Embryo-Suspensor-Massen = ESM), Embryoreifung, Konversion reifer Embryonen zu Keimpflanzen sowie Akklimatisierung. Die Induktion und Etablierung der ESM an reifen zygotischen Embryonen aus Samen war bei Abies nordmanniana nur auf Nährmedien mit hoher Cytokininkonzentration möglich (10-30 mM BAP oder 5 mM TDZ). Die Vermehrung der ESM erfolgte auf fünf Basalmedien (DCR, _MS, _BLG, SH und MSG) und zeigte eine ausgeprägte Abhängigkeit des ESM-Wachstums vom Genotyp.

Die Embryoreifung zeigte neben den klonalen Unterschieden eine starke Abhängigkeit vom Basalmedium, der ABA-Konzentration und der Art und Konzentration des Osmotikums. Generell erfolgte aber eine Reifung auf allen o.g. Medien, wenn diese 30g/l Maltose, 750 mg/l L-Glutamin, 50 mg/l L-Asparagin, 40-60 mM ABA und 5-10% PEG 4000 enthielten. Die Konversion reifer Embryonen zur Keimpflanzen lag zwischen 20% bis 70%. Eine Zugabe von 1 g/l Aktivkohle ins Konversionsmedium ergab eine wesentliche Verbesserung der Konversionsrate. Die Akklimatisierung der Keimpflanzen ist noch unbefriedigend. Problematisch sind insbesondere die Überwindung der artspezifischen Dormanz der Jungpflanzen im Keimblattstadium und die Anpassung der Jungpflanzen zur Erde.

 Tel.: 030-20939013. E-Mail: adirahmat@netscape.net

Die Rolle von Glycolyse und Fermentation unter Sauerstoffmangel bei unterschiedlich staunässetolerante Getreidearten

Angelika Mustroph, G. Albrecht und E.-M. Wiedenroth

 Institut für Biologie, AG Botanik, Humboldt-Universität zu Berlin, Späthstr. 80/81, D-12437 Berlin

 Jährlich sind viele landwirtschaftlich genutzte Flächen zeitweilig von Überflutungen bedroht, die große Ernteausfälle verursachen. Um die Anpassungsfähigkeit von Pflanzen an diesen Stressor besser verstehen zu können, wurden drei wirtschaftlich bedeutende und unterschiedlich staunässetolerante Gräser hinsichtlich ihres Kohlenhydratstoffwechsels miteinander verglichen. Der tolerante Reis wird den beiden sensitiven Arten Mais und Weizen gegenübergestellt. Dazu wurden die Pflanzen nach einer belüfteten Vorkultur für 4 Tage entweder nur im Wurzelbereich (Hypoxie) oder die gesamte Pflanze (Anoxie) mit Stickstoff begast. Es wurden neben morphologisch-anatomischen Parametern lösliche Kohlenhydrate sowie Enzyme des Grundstoffwechsels untersucht.

 Reis vermeidet die Wirkung des Stressors, indem er in den Wurzeln ein Aerenchym ausbildet sowie mit reduzierter Stoffwechselleistung Energie spart. Durch beide Vorgänge hat Reis unter Hypoxie nur geringfügig ansteigende Gärungsaktivitäten, bei Weizen und Mais dagegen erhöhen sich diese stark. Die Aktivitäten der Enzyme der Glykolyse reagieren dagegen nur leicht ansteigend bei den intoleranten Arten und unverändert beim Reis. Bei den Saccharose-spaltenden Enzymaktivitäten wird der ATP-sparende Weg der SuSy im Gegensatz zu dem der Invertasen gefördert. Beide sensitiven Arten zeigen zudem unter Hypoxie eine Anhäufung der löslichen Kohlenhydrate.

Nach Anoxie sind die Zuckergehalte aller Arten vermindert. Ebenso verringert sind die Enzymaktivitäten, ausgenommen die der Gärungsenzyme. Der Reis ist nach 4 Tagen Anoxie noch deutlich vitaler als die beiden sensitiven Arten, was auf das Vorhandensein einer anaeroben Amylase in der Karyopse zurückzuführen ist.

 e-mail: angelika.mustroph@student.hu-berlin.de

Cryoprotectin binds to thylakoid membranes and reduces membrane fluidity

Hany Sror , Dirk Hincha und Jürgen Schmitt

 Institut für Pflanzenphysiologie, Freie Universität Berlin, 14195 Berlin, Germany

 It has been show that a protein (Cryoprotectin) from cold-acclimated cabbage (Brassica oleracea L.) protects thylakoid membranes against freeze - thaw damage. Protein sequencing of purified cryoprotectin showed that it is a member of the lipid transfer protein (LTP) gene family. The functional mechanism of cryoprotection is unknown. In this study the binding of cryoprotectin with thylakoid membranes and the associated changes in the physical properties of the membranes were studied as a possible mechanism of cryoprotection by cryoprotectin. The results show that cryoprotective activity can be removed from cryoprotectin crude extract by thylakoid membranes. Antibodies raised against two synthetic peptides derived from a non-specific lipid transfer protein (wax9) identified a 10KD protein in western blots of cryoprotectin crude extract. This protein disappeared gradually from the western blots of supernatants and was found in the western blots of thylakoid pellet proteins. Evidence for binding of cryoprotectin with thylakoids was obtained by determination of freeze - thaw damage of pre-loaded thylakoids after washing for different times. The results show that cryoprotection does not change by washing of thylakoids pre-loaded with cryoprotectin and also the 10KD protein does not disappear from the western blots of thylakoid pellets after several rounds of washing. Presence of 5mM glucose 6-sulfate in the cryoprotectin crude extract completely inhibits the cryoprotective activity as well as the binding of thylakoids with cryoprotectin as demonstrated by western blots of supernatants and thylakoid pellets. Fluorescence depolarization measurements with both probes trimethyl ammonium -1,6diphenyl 1,3,5 hexatriene (TMA-DPH) and trimethyl ammonium propyl -1,6diphenyl 1,3,5 hexatriene (TMAP-DPH) showed a significant reduction of lipid fluidity in the presence of cryoprotectin. In contrast the hydrophobic core of the membrane as probed with 1,6 diphenyl-1,3,5 hexatriene (DPH) was not influenced . While in the presence of 5mM glucose 6 sulfate the fluidity of thylakoid membranes was not affected in both hydrophobic region probed by DPH and the hydrophilic part and head group region probed by TMA-DPH and TMAP-DPH .

 The data strongly suggest that the mechanism of cryoprotection includes binding with thylakoids and reduction of the fluidity of membrane lipids in the hydrophilic region, resulting in a lower solute permeability of the membranes and preventing freeze - induced solute loading.

Untersuchungen zum Transfer von Resistenzen gegen Leptosphaeria maculans in den Raps

H. Winter, A. Diestel, S. Gärtig, N. Krone und M.D. Sacristán

 Institut für Biologie - Angewandte Genetik, Freie Universität Berlin, Albrecht-Thaer-Weg 6, 14195 Berlin

 Die Wurzelhals- und Stengelfäule, hervorgerufen durch den Ascomyceten Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. et De Not. [Phoma lingam (Tode ex Fr.) Desm.], ist die weltweit wichtigste Krankheit des Rapses (Brassica napus L., Genom AACC, 2n=38). Als Alternative zu bisherigen Resistenzen, die sich hauptsächlich von der französischen Rapssorte "Jet Neuf" und Brassica-Arten mit dem B-Genom ableiten, nimmt die Bedeutung von Wildarten der Familie Brassicaceae zu. Deren oft hoher Resistenzgrad ist von besonderem Wert, da einige australische Isolate, wie z.B. M1, in der Lage sind, die bisher als weitgehend stabil und absolut geltende B-Genom-Resistenz, insbesondere von B. juncea (L.) Czern. (BBCC, 2n=36), zu durchbrechen.

 Gegenstand dieser Studie sind Rückkreuzungsnachkommenschaften aus intergenerischen Kreuzungen des Rapses mit Sinapis arvensis L. (Ackersenf, SarSar, 2n=18) bzw. Coincya monensis (L.) Greuter & Burdet (Schnabelsenf, CmCm, 2n=24) sowie dihaploide B. napus-B. juncea-Rekombinationslinien. Das Ziel des Vorhabens besteht in der Entwicklung genetisch stabiler rekombinanter Rapslinien (2n=38) mit Resistenzen gegen L. maculans aus den Donorarten. In ihnen soll jedoch Anteil an Donorchromatin möglichst gering sein. Diese werden dann in Kreuzungsexperimente zur Analyse der Vererbung der Resistenzintrogression und zur Kartierung derselben einbezogen.

 Die Pflanzen werden hinsichtlich ihres Resistenzverhaltens gegenüber zwei aggressiven Isolaten von L. maculans, W4 aus Deutschland und M1 aus Australien, unter Verwendung unterschiedlicher Inokulationsmethoden in verschiedenen Entwicklungsstadien und Umwelten charakterisiert. Als Methode der Wahl zur genauen und vergleichenden Einschätzung des Resistenzniveaus im Kotyledonen- und im Adultstadium der Pflanze im Gewächshaus wurde der Test mit Doppelinokulation entwickelt und optimiert. Für die Gruppen mit C. monensis bzw. S. arvensis als Resistenzdonor gilt: Adultresistenz wird in größerem Maße vererbt als Kotyledonenresistenz, beide beruhen auf unterschiedlichen Genen.

 Die Reduktion des Fremdchromatinanteils in den sukzessiven Generationen wird mit Hilfe der Genomischen in situ-Hybridisierung (GISH) detektiert. So war in den B. napus-S. arvensis-Linien die Präsenz eines akrocentrischen Additionschromosoms von S. arvensis stets mit Adultresistenz der Pflanze verbunden. Resistente Pflanzen mit monosomen Additionen konnten auch unter den B. napus-C. monensis-Rückkreuzungsnachkommen selektiert werden. Für beide Gruppen gibt es bereits Hinweise auf mittels GISH nicht nachweisbare Introgressionen von "Resistenzchromatin" in Pflanzen mit normalem Raps-Karyotyp. Durch Selbstungen sollen derartige heterozygote Introgressionen in der Folgegeneration homozygot fixiert werden.

 Um RAPD-PCR-Marker für die jeweiligen Resistenzen zu finden, wird an aufspaltenden Nachkommenschaften der B. napus-C. monensis- und B. napus-S. arvensis-Linien die Methode der bulk segregant analysis angewendet.

 Die Analyse der Meiose von vorher phytopathologisch und durch GISH charakterisierten Pflanzen dient der Selektion der genetisch stabilsten Genotypen mit 38 Chromosomen. Darüber hinaus soll das meiotische Paarungsverhalten der Additions- bzw. Substitutionschromosomen Aussagen zu ihrer Transmissionsrate und zur Wahrscheinlichkeit von Introgressionen ermöglichen.

Expressionsanalyse der Eisenmangelantwort an

Arabidopsis thaliana

Oliver Thimm1, Bernd Essigmann2, Thomas Altmann2 und Thomas J. Buckhout1

 1Angewandte Botanik, Institut für Biologie, Humboldt-Universität Berlin, Invalidenstr. 42, 10115 Berlin

 2Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie, Am Muehlenberg 1, 14476 Golm

 Eisenmangel führt an höheren Pflanzen zu Veränderungen im Genexpressionsmuster. Mit Hilfe der Microarraytechnik sollten die durch eine Unterversorgung an Eisen in Arabidopsis thaliana differentiell exprimiertern Gene identifiziert werden. Es wurde eine 16.000 Klone umfassende EST- Kollektion verwendet, dies entspricht ca. 7000 nicht-redundanten Genen und damit etwa 1/3 des Arabidopsisgenoms. Die cDNA-Sonden sind aus Sprossen und Wurzeln von a) 3 Tagen und b) 7 Tagen eisenunterversorgten Pflanzen präpariert worden. Für eine Kandidatenliste wurden Klone ausgewählt, die durch Eisenmangel mindestens 2,5-fach induziert bzw. reprimiert wurden. So wurden nach 3 Tagen Eisenmangel in Spross und Wurzel 616 Klone induziert und 496 reprimiert. Nach 7 Tagen Eisenunterversorgung konten 412 induzierte bzw. 261 reprimierte Klone identifiziert werden. Die Ergebnisse wurden mit Clusteranalyse, graphischer Darstellung und Literaturvergleich überprüft. Nach Datenbankvergleich der EST-Sequenzen konnten die ausgewählten Klone nach ihrer putativen Funktion gruppiert werden.

Unterschiede im Proteinmuster von Chlamydomonas reinhardtii in Abhängigkeit von der Eisenernährung

Immo Reinhardt, Luca Canuti, Alexandra Herbik und Thomas J. Buckhout

 Angewandte Botanik, Institut für Biologie, Humboldt-Universität Berlin, Invalidenstr. 42, 10115 Berlin

 Die einzellige Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, die auf Eisenmangel wie dikotyle Pflanzen mit der Induktion einer Fe3+-Chelatreduktase reagiert, dient als Modellorganismus zur Identifizierung von Proteinen, die an der regulierten Eisenaufnahme beteiligt sind. Hierzu wurden die Zellen unter Fe-suffizienten bzw. -defizienten Bedingungen kultiviert. Algen, die 24h in Fe-Mangelmedium wuchsen, zeigten eine mindestens 15fach erhöhte Fe3+-Chelatreduktaseaktivität. Nach Aufschluß der Zellen wurden eine lösliche und eine mikrosomale Fraktion gewonnen. Aus letzterer wurden über ein Polymer-2-Phasen-System Plasmamembranen angereichert. Umfang-reiche Versuche mit verschiedenen Detergenzien zur Solubilisierung der Membranproteine sowie unterschiedlichen pH-Gradienten in der isoelektrischen Fokussierung führten zur Etablierung eines Systems, das die zweidimensionale elektrophoretische Trennung der Proteine ermöglicht. Ca. 180 Polypeptide der Plasmamembran sowie mehr als 300 Polypeptide der löslichen Fraktion konnten reproduzierbar aufgelöst werden. Sowohl bei Plasmamembran- als auch bei löslichen Proteinen wurden je 15 unter Fe-Mangel differentiell synthetisierte Polypeptide gefunden. Die Sequenzierung mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie wird derzeit durchgeführt. Bisher konnten 2 Polypeptide der löslichen Fraktion nach Sequenzierung und Datenbankanalyse identifiziert werden.

Untersuchungen zur Expression organellärer RNA-Polymerasen in Arabidopsis thaliana

Carola Emanuel, Thomas Börner und Andreas Weihe

 Institut für Biologie, AG Genetik, Humboldt Universität Berlin, Chausseestr. 117, 10115 Berlin

 Im Kerngenom von Arabidopsis thaliana konnten 3 Gene für organelläre RNA-Polymerasen (RpoT;1-3) des Bakteriophagentyps identifiziert werden. Ein in vivo-Nachweis der subzellulären Lokalisation von RpoT;1 und RpoT;3 und unlängst auch von RpoT;2 wurde durch Targetingstudien mit GFP-Fusionsproteinen erbracht. Im Fall der Plastiden übernimmt eine weitere im Plastom kodierte RNA-Polymerase eine Funktion in der Transkription. Um Hinweise auf die Funktionen der einzelnen RNA-Polymerasen in der organellären Transkription von höheren Pflanzen zu erhalten, wurde die Expression der RpoT-Gene untersucht.

 Northern Blot-Analysen ließen eine sehr geringe Abundanz der RpoT-Transkripte erkennen. Die quantitative real-time RT-PCR bietet die Möglichkeit einer äußerst sensitiven Bestimmung der Transkriptakkumulation. Diese Methode wurde verwendet, um die Transkriptakkumulationen der RpoT-Gene in unterschiedlichen Geweben der Pflanze zu untersuchen. Es wurden RNA-Präparationen aus Blättern, Blüten, Stengeln sowie Wurzeln von Arabidopsis thaliana miteinander verglichen. Als interner Standard diente die Transkriptakkumulation der cytoplasmatischen 18S-rRNA.Die gewonnenen Daten zeigen eine erhöhte Transkriptakkumulation der RpoT-Gene im Wurzel- und insbesondere im Blütengewebe. Im Vergleich der organellären RNA-Polymerasen RpoT;1-3 zeigt die mitochondriale RNA-Polymerase (RpoT;1) in allen untersuchten Geweben die stärkste Transkriptanreicherung.

 Zur Bestätigung der gewonnenen Daten erfolgt eine Analyse von transgenen Pflanzen, die GUS unter der Kontrolle der RpoT-Promotorregion exprimieren. Mit dem histochemischen GUS-Assay kann hier ein Nachweis der gewebespezifischen Transkription der RpoT-Gene erfolgen.

DOF-Transkriptionsfaktoren: Funktionsanalyse in Schließzellen und anderen Geweben

Slobodan Ruzicic und Kerstin Schulz

Universtität Potsdam, Institut für Biochemie und Biologie, Karl-Liebknecht-Str. 24-25, Haus 20, 14476 Golm
 

Tel.: 0331-977-2650

 Fax.: 0331-977-2512

 email: keschulz@rz.uni-potsdam.de

Einzelzellanalytik hinsichtlich der Ionen- und Aminosäurekonzertionen und der Genexpression in Blättern

Stephan Brandt, Kathleen Arlt, Lothar Willmitzer und Julia Kehr

 Max Planck Institut für molekulare Pflanzenphysiologie, Am Mühlenberg 1, 14476 Golm

 Um Stoffwechselvorgänge, wie z.B. interzelluläre Kommunikation, Metabolitentransport und -lagerung, zu verstehen, ist es notwendig, die lokalen Konzentrationen von Metaboliten und Ionen sowie die Expression bestimmter Gene zu kennen. Die meisten analytischen Standardmethoden benötigen Ausgangsmengen, die ganzen Organen oder zumindest Blattscheiben o.ä. entsprechen. Daher liefern sie lediglich Durchschnittswerte über mindestens 3- 4 Zelltypen (z.B. Blattscheibe: Epidermis, Palisadenparenchym, Schwammparenchym, Xylem- und Phloemzellen). Durch Zellvereinzelungsprotokolle wie Protoplastierung, Tissue Peels oder epidermale Fragmente erhält man u.U. genügend uniformes Gewebematerial, aber dies entstammt nicht mehr seiner natürlichen Umgebung. Um eine höhere Auflösung zu erreichen, wäre eine Einzelzellanalytik wünschenswert. Mittels Glasmikrokapillaren ist es möglich, einzelne Zellen an intakten Pflanzen zu ernten. Es konnte gezeigt werden, dass dies für nahezu alle Blattzelltypen möglich ist. Da diese Proben aber nur Volumina zw. 50 und 150 pl besitzen, sind Standardmethoden wie GC- MS oder HPLC nicht für die Analyse einsetzbar.

 Hier sollen exemplarisch einige Verfahren beschrieben werden, mittels derer Einzelzellanalytik betrieben werden kann. Im einzelnen werden Methoden zur Bestimmung von Kationen und Aminosäuren erläutert. Desweiteren werden Ergebnisse aus Einzelzell RT- PCR Ansätzen und erste Arrayhybridisierungen mit aus gepoolten Einzelzellinhalten gewonnener Sonden vorgestellt.

Positionsklonierung des SCB1 Gens aus Arabidopsis thaliana

Arne Schäfer und Thomas Altmann

 Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie, Am Muehlenberg 1, 14476 Golm

 Brassinosteroide (BRs) sind Polyhydroxysteroide mit großer struktureller Ähnlichkeit zu tierischen Steroidhormonen. Diese erst kürzlich als neue Klasse von Phytohormonen anerkannte Stoffgruppe kommt ubiquitär im Pflanzenreich vor und ist essentiell für pflanzliches Wachstum, Differenzierungsprozesse und Fertilität. Bislang ist nur sehr wenig über die Mechanismen der BR abhängigen Signalübertragung bekannt. Genetische Ansätze zur Identifizierung von Komponenten der BR-Signalübertragung in A. thaliana führten bisher lediglich zur Identifizierung eines Gens (BRI1). Um weitere Faktoren der BR-Synthese oder BR-abhängiger Signalübertragungsprozesse zu identifizieren, wurde homozygotes Saatgut einer BR-defizienten Mutante (cbb3) chemisch mutagenisiert und aus diesem Mutageneseansatz eine Linie mit partiell supprimierten cbb3-Phänotyp isoliert. Die zur Suppression führende Mutation (scb1) betrifft einen neuen Lokus, der unabhängig vom cbb3-Lokus ist und sich dominant gegenüber dem entsprechenden Wildtyp-Allel verhält. Durch positionale Klonierung unter Verwendung der SSCP-Technik wird das SCB1-Gen isoliert, um dessen Identität aufzuklären und seine Rolle innerhalb des BR-Metabolismus oder der BR-Signaltransduktionsmechanismen zu untersuchen.

A
 

Alawday 5

 Albrecht 13

 Altmann 16; 21

 Arlt 20
 

B
 

Benning 8

 Börner 18

Brandt 20

 Buckhout 16; 17
 

C
 

Canuti 17
 

D
 

Diane 11

 Diestel 15

 Dörmann 8; 9
 

E
 

Emanuel 18

 Essigmann 16

 Ezhova 7
 

F
 

Froehlich 8
 

G
 

Gärtig 15

 Grimm 5; 6; 7
 

H
 

Hartmann 9

 Herbik 17

 Hilger 11
 

K
 

Kehr 20

Kelly 8

Krepinsky 10

 Krone 15

L
 

Lermontova 6; 7
 

M
 

Mustroph 13
 

P
 

Papenbrock 5
 

R
 

Rahmat 12

 Reboud 7

Reinhardt 17

Ruzicic 19
 
 

S
 
 

Sacristán 15

Schäfer 21

 Schmitt 14

 Schnarrenberger 10

 Schulz 19

Simon-Rosin 3

Sohlenkamp 4

Sror 14
 
 

T
 
 

Thimm 16
 
 

U
 
 

Udvardi 3; 4
 
 

V
 
 

von Orlow 9

Voronetskaya 7
 
 

W
 
 

Weihe 18

 Wiedenroth 13

 Willmitzer 20

Winter 15
 
 

Z
 
 

Zoglauer 12